Peter Parker (Andrew Garfield) strever fortsatt med å balansere sitt ansvar som superhelten Spider-Man med et liv som student. Han  ønsker i tillegg å tilbringe tid med kjæresten Gwen Stacy (Emma Stone). Men når han, med hjelp av kameraten Harry Osborn, begynner å grave seg ned i farens fortid, oppdager han flere dypt begravde hemmeligheter. Samtidig må han ta opp kampen mot to nye, farlige motstandere, Electro og Rhino, som begge har én ting til felles: OsCorp.